度強光蛍123456248東京都医学検査 Vol. 53 No. 2蛍蛍光光染染色色、、画画像像取取りり込込みみ＆＆解解析析*エーエムアール（株）ホームページより核核酸酸抽抽出出ササンンププルル、、反反応応液液調調製製PCR反反応応遺伝子の基礎PCRの基礎リリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎リアルタイムPCRを利用した遺伝子関連検査技術リアルタイムPCRの設計フローデジタルPCRとはDNAポリメラーゼが相補的なヌクレオチド三リン酸を付加させ、DNA鎖を合成特定のDNA配列を短時間で倍々に増幅する1 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Ampliconサイクル数リアルタイムPCRシステム＝サーマルサイクラー+ 蛍光検出器温度を下げる（50～60℃）と、プライマーが相補的に結合し合成のスタート位置となるステップ1～3の温度変化を1サイクルとし、30～40サイクル繰り返す逆転写反応RNA逆転写プライマー逆転写酵素（RTase）cDNA両活性を併せ持つポリメラーゼを使用すると1反応でPCR増幅が可能。例)Tthポリメラーゼ、Z05ポリメラーゼ21CCyycclleessタターーゲゲッットト配配列列ののココピピーー数数163220641,048,576301,073,741,824PCRは理論的には指数関数的に増幅するNサイクル後のPCR産物量は初初めめののDDNNAA量量××22NN と表すことができるゲゲルル電電気気泳泳動動展展開開液液添添加加、、ククロロママトト反反応応**目目視視結結果果判判定定1.PCR反応中、PCR産物に蛍光標識DNAプローブを結合1サイクル毎に蛍光を読み取ることで、2.PCR産物が増えていく様子をモニターする1517PCRPCRプライマーRNAcDNA･･････1916182022PPCCRRののスステテッッププステップ3伸長PPCCRR増増幅幅ののルルーールル1サイクルで2倍にPPCCRRをを用用いいたた検検出出のの際際のの手手順順【【エエンンドドポポイインントトPPCCRR法法】】リリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎PCR反応をモニタリングする技術12345678…PPCCRRののスステテッッププステップ2アニール（再結合）PPCCRRののスステテッッププ1本が2本に検検体体ががRRNNAAのの場場合合RT-PCRPCRはDNAを増幅する技術RNAはcDNAに変換（逆転写）してPCRに用いるTable of contents240
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