⮚⮚⮚⮚⮚⮚⮚⮚⮚高い値C✓✓✓⮚高い度強光蛍）go（度強光蛍度強光蛍量物産RCP度強光蛍ABCD1lt⮚⮚⮚⮚東京都医学検査 Vol. 53 No. 2増増幅幅がが頭頭打打ちちににななるる原原因因•酵素の失活•基質の枯渇•プライマーの枯渇•阻害物質の蓄積（ピロリン酸など）↓機器の検出限界Ct: Critical threshold value（またはThreshold Cycle）Cq: Quantification CycleCp: Crossing Point エエンンドドポポイインントトPPCCRR法法操作性煩雑操作ステップがいくつもある反応後操作が必要結果を得るまでに時間がかかるスループットが低い検出に発がん性のEtBr、UVを使用コンタミネーションのリスク電気泳動が必要なため、PCR反応後ふたを開けて増幅産物を取り出す必要がある感度感度が限られる⮚1コピー検出には2nd PCRが必要定量性に乏しい遺伝子の定量再現性正確性乏しいバラつきが大きいリリアアルルタタイイムムPPCCRR法法簡便、迅速増幅と検出が同時進行結果を得るまでの時間が短いスループットが高い心配がない電気泳動が不要なので、増幅産物を取り出す必要がない高感度⮚1コピーを検出可能定量可能幅広い測定レンジ（9 log以上）バラつきが小さい増幅曲線はS字になる指数関数的増幅領域とプラトー領域が存在するThresholdライン指数関数的増幅領域が重要PCR後期やプラトー領域ではランダムな反応となるCの方が高濃度だがプラトーの高さはDより低いサイクル数✔直線性を得られるレンジが非常に狭い⇒定定量量性性にに乏乏ししいい✔一定のサイクルで反応をストップ✔PCR後に電気泳動が必要✔SYBR Green I ✔ResoLight など✓✓TTaaqqMMaann ププロローーブブ✓✓ハイブリダイゼーションプローブ✓✓Q プローブなど理理論論的的なな増増幅幅曲曲線線任意の蛍光強度に達したサイクル数で比較直線性を得られるレンジが広く、検量線が書ける⇒定定量量がが可可能能サイクル数から初期鋳型DNA量がわかる増幅の様子をモニタリングしているので電気泳動は不要⇒ココンンタタミミネネーーシショョンンのの心心配配ががなないい✔SYBR Green I ✔ResoLight など✓✓TaqMan プローブ✓✓ハイブリダイゼーションプローブ✓✓Q プローブなどPCR反応初期ではPCRの阻害となる要因がほとんどないため規則正しい増幅（指数関数的増幅領域）となる（A）PCR反応が進むにつれ徐々に様々な阻害の影響を受け始め予測不能なランダムな反応性になる（B）規則正しい増幅（指数関数的増幅領域）に閾値を設けて解析を行う⇒感感度度がが乏乏ししいい⇒ココンンタタミミネネーーシショョンンののリリススククがが高高いい1次関数的増幅領域指数関数的増幅領域サイクル数1次関数的増幅領域指数関数的増幅領域105104103102101Ct値151218サイクル数2124●イインンタターーカカレレーータターー法法～～配配列列にに依依存存ししなないい～～DNAの二重鎖に結合し、二本鎖DNA量に比例して発する蛍光シグナルを用いる●ププロローーブブ法法～～配配列列特特異異的的～～プライマー間に遺伝子配列特異的な蛍光プローブを設計し、この蛍光プローブが発する蛍光シグナルを用いるPCR 産物量＝初期鋳型量x2n(サイクル数)ププララトトーー領領域域リアルタイムPCRでは増幅後期またはプラトーに達した時点ではなく指数関数的増幅期の初期が重要10プラトー領域0.10.010.001242118151210510410310223縦軸log表示1次関数的増幅領域指数関数的増幅領域サイクル数25101102103104105101102103104105濃度（コピー数）272924262830通通常常ののPPCCRR任意のサイクル数でのPCR産物量で比較105104103102101●イインンタターーカカレレーータターー法法～～配配列列にに依依存存ししなないい～～DNAの二重鎖に結合し、二本鎖DNA量に比例して発する蛍光シグナルを用いる●ププロローーブブ法法～～配配列列特特異異的的～～プライマー間に遺伝子配列特異的な蛍光プローブを設計し、この蛍光プローブが発する蛍光シグナルを用いるリリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎エンドポイントの蛍光強度リリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎従来のPCR（エンドポイントPCR）エエンンドドポポイインントトPPCCRR法法ととリリアアルルタタイイムムPPCCRR法法まとめ検検出出フフォォーーママッットトインターカレーター法とプローブ法リリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎増幅曲線の実際123456…リリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎増幅曲線の実際～リニア表示とlog表示～123456…サイクル数リリアアルルタタイイムムPPCCRRのの基基礎礎エンドポイント法との違い検検出出フフォォーーママッットトインターカレーター法とプローブ法123456…241
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