⮚＋と－の数から、コピー数を算出.⮚⮚東京都医学検査 Vol. 53 No. 2反応溶液調製検体核酸プライマー/プローブ基質/酵素/バッファー反応プレート/チューブに分注シーリング/ 遠心パーティショニング検量線を作成し、Ct値から定量値を算出⮚PCR増幅&検出解析アッセイデザインアッセイデザインアッセイデザインアッセイデザインアッセイデザイン2次構造(ダイマー,ヘアピン)2次構造データベース相同検索反応溶液微細分画（Partition) に分散使用されるデータベース・NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）・Ensembl （https://www.ensembl.org/index.html）例：ヒトALDH2のゲノム配列の検索遺伝子の基礎PCRの基礎リアルタイムPCRの基礎リアルタイムPCRを利用した遺伝子関連検査技術リアルタイムPCRの設計フローデデジジタタルルPPCCRRととはは5557596160ココピピーー//mmLLRapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Directly from Sterile or Nonsterile Clinical Samples by a New Molecular Assay JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 2003, p. 254–260 Vol. 41, No. 1検体核酸プライマー/プローブ基質（dNTPs）酵素バッファー565862リアルタイムPCRデジタルPCRPCR*ポアソン分布に従った統計解析処理により定量値を算出反応後蛍光検出：ある/なし（デジタルデータ）▪アンプリコンサイズ：60～200bp▪特異性はサイズに依存しない▪複製数↑▪複製速度↑、効率↑▪DNAダメージによる小断片の影響↓▪プライマーGC%：35～65%、Tm値60℃▪両プライマーはサイズより、Tm値をそろえる（1度以内が望ましい）▪PCRアニーリング温度の均一化で複数のアッセイが同時進行可能▪プローブGC%：45～65%、Tm値プライマーより5~10℃上、サイズ<30base▪RNA鎖にハイブリしない鎖に設計する✔検量線不要で、絶対定量ができる✔低コピーにおける感度/精度はNGSより高い✔qPCRでは不可能な、1000vs.1100などの微小差も明確に区別できる✔阻害に強い：増幅効率低下等の影響が少ないターゲット遺伝子配列の検索核酸配列データベースの利用Table of contentsリアルタイムPCR vs デジタルPCRフローLightCycler480とdigital LightCyclerを例にインターネットで入手可能なツールターゲット遺伝子配列の検索論文参照ププラライイママーー、、ププロローーブブのの設設計計デザイン条件デジタルPCRの原理245
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